2019 Solved Old Paper (BOT - 403D) New OK

कायिक भ्रूणजनन (Somatic Embryogenesis):-

सामान्य परिचय (General Introduction):-

·    कायिक भ्रूणजनन (Somatic Embryogenesis):- कायिक कोशिका से कायिक भ्रूण के निर्माण की प्रक्रिया को कायिक भ्रूणजनन कहते हैं।

(The process of the development of a somatic embryo from a somatic cell is called somatic embryogenesis.)

·    भ्रूणाभ (Embryoid):- जाइगोटिक भ्रूण की तुलना में कायिक भ्रूण छोटा सुसंगठित संरचना होता है जिसे भ्रूणाभ कहते हैं।

(In comparison to the zygotic embryo, the somatic embryo is a small and well-organized structure called the embryoid.)

In Vitro Pollination and Fertilization:-
Introduction:-
> ‘vitro’ means glass or glassy substances. So, ‘in vitro’ means in glass or glass tube. 
> Cultivation of plant tissue or other organs on artificial media in a test tube or conical flask is called in vitro technique. 
> The process of seed formation following stigmatic pollination of cultured pistil has been referred to as in vitro pollination and the development of seed through in vitro fertilization.
Types of in vitro pollination:-
i. Ovular pollination:- Application of pollen to excised ovule. 
ii. Ovarion pollination:- Application of pollen to excised ovary. 
iii. Placental pollination:- Application of pollen to ovules attached to the placenta. 
iv. Stigmatic pollination:- Application of pollen to stigma.
Mutant cell lines:-
Introduction:-
> Mutation occurring in microorganism can be detected and efficiently isolated from the parent organism of other mutants. 
> While studying we must be aware of wild type characters of an organism ,so the mutants can easily detected. 
> In bacteria and other haploid microorganism, the detection system are straight forward because any new allele should be observed immediately.
> In albino mutation, the detection is very simple. It requires only change in colour of bacterial colony. > The other detection systems are rather complex. 
Genetic variation:- These refers to differences in the DNA sequences among individuals of the same species. These variations make each individual genetically unique (except identical twins) and contribute to diversity within populations.
Types of genetic variations:-
i. Single nucleotide polymorphisms (SNPs):- A change in a single DNA base (e.g., A replaced by G). These are the most common type of genetic variation.
ii. Insertions and deletions (Indels):- Addition or loss of one or more DNA bases.
iii. Copy number variations (CNVs):- Large segments of DNA that are duplicated or deleted.
iv. Chromosomal variations:- Changes in chromosome number or structure, such as translocations, inversions, duplications, or deletions.

भ्रूण बचाव (Embryo Rescue):-

1. सामान्य परिचय (General Introduction):-

·   परिभाषा (Definition):- ऐसा अपरिपक्व या कमजोर भ्रूण जो नष्ट हो सकता है अपने आप पौधे में विकसित नहीं हो सकता उसे ऊतक संवर्धन तकनीक के द्वारा स्वस्थ पौधे में विकसित करने की प्रक्रिया को भ्रूण बचाव कहते हैं।

(Through tissue culture technique, the process of developing a healthy plant from an immature or weak embryo, which can be destroyed and cannot develops into the plant on its own, is called embryo rescue.)

·   दूरस्थ संकरण से भ्रूणपोष का सही प्रकार से विकास नहीं हो पाता है जिससे भ्रूण के नष्ट होने की संभावना बढ़ जाती है।

(Endosperm does not develop properly in distant hybridization, which increases the chances of embryos being destroyed.)

·   भ्रूण बचाव प्रक्रिया में कृत्रिम पोषक माध्यम भ्रूणपोष के विकल्प का कार्य करता है। जिससे भ्रूण का विकास   बिना रुके लगातार चलता रहता है।

(The artificial nutrient medium serves as an alternate of endosperm in the embryo rescue process. Due to which the development of the embryo continues continuously without stopping.)

2. सिद्धान्त (Principle):- भ्रूण विकास 3 अवस्थाओं में होता है। पोषण आवश्यकता उसी के अनुसार परिवर्तित   होती रहती है।

(Embryonic development occurs in 3 stages. The nutritional requirement varies accordingly.)

i. विषमपोषी अवस्था (Heterotrophic Phase):- यह एक प्रारम्भिक अवस्था है जिसमें भ्रूण पोषकों की आपूर्ति के लिए अधिकतर भ्रूणपोष मातृक ऊतक पर निर्भर रहता है।

(This is an early stage in which the embryo mostly depends on endosperm and maternal tissue for supplying nutrients.)

ii. स्वपोषी अवस्था (Autotrophic Phase):- इस अवस्था में भ्रूण में वृद्धि के लिए आवश्यक पदार्थों के निर्माण के लिए उपापचय क्षमता विकसित हो जाती है। जिससे भ्रूण धीरे धीरे आत्मनिर्भर हो जाता है।

(At this stage, metabolic capacity is developed in the embryo to produce the necessary substances for growth. By which the embryo gradually becomes self-dependent.)

iii. मध्यस्थ अवस्था (Intervening Phase):- यह विषमपोषी स्वपोषी अवस्था के मध्य की नाजुक अवस्था है। इस अवस्था पर पोषक आपूर्ति अत्यधिक परिवर्तनशील होती है जो अधिकतर पादप जाति पर निर्भर करती है।

(It is a critical stage between heterotrophic and autotrophic. Nutrient supply at this stage is highly variable, depending mostly on plant species.)

·  परिपक्व भ्रूण की तुलना में अपरिपक्व भ्रूण संवर्धन के लिए अधिक जटिल माध्यम की आवश्यकता होती है।

(Immature embryos require a more complex medium than mature embryos for culturing.)

·  भ्रूण के पूर्ण विकास के लिए इसे कई बार एक माध्यम से निकालकर दूसरे माध्यम में स्थानांतरित करना पड़ता   है।

(For complete development of the embryo, it has to be removed from one medium and transferred to another medium.)

3. भ्रूण बचाव के लिए आवश्यक कारक (Factors Required for Embryo Rescue):-

a. माध्यम (Medium):-

·  भ्रूण बचाव के लिए अधिकतर MS माध्यम B5 माध्यम का उपयोग किया जाता है।

(Mostly MS medium and B5 medium are used for embryo rescue.)

·   माध्यम का प्रकार घटक भ्रूण विकास की अवस्था पर निर्भर करता है।

(The type and component of the medium depends on the stage of embryo development.)

·  विषमपोषी अवस्था के भ्रूण के लिए जटिल माध्यम की आवश्यकता होती है।

(The heterotrophic stage embryo requires a complex medium.)

Ø  ग्लूटेमिन ऐस्पार्जिन अमीनो अम्ल

(Glutamine and Aspargine amino acids)

Ø  विभिन्न विटामिन्स (Different vitamins)

Ø  कैसीन हाइड्रोलाइसेट (Casein hydrolysate):- 

ये विभिन्न अमीनो अम्लों से प्रचुर होते हैं जिनका उपयोग कई बार किया जाता है।

(They are rich in various amino acids which is used many times.)

Ø  सुक्रोज (Sucrose):- इसका उपयोग ऊर्जा स्त्रोत ओस्मेटिकम के रूप में किया जाता है।

(It is used as an energy source and osmaticum.)

Ø  अमोनियम नाइट्रेट (Ammonium Nitrate):- नाइट्रोजन स्त्रोत के लिए इसका उपयोग किया जाता है।

(It is used for nitrogen sources.)

Ø  नारियल का द्रव भ्रूणपोष (Liquid Endosperm of Cocconut):- 

यह माध्यम में विशिष्ट अमीनो अम्ल, शर्करा, वृद्धि नियामक आदि की आपूर्ति करता है।

(It supplies specific amino acids, sugars, growth regulators etc. in the medium.)

Ø  सामान्यतया वृद्धि नियामकों की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि ये कैलस निर्माण को प्रेरित करते हैं।

(Growth regulators are generally not required as they induce callus formation.)

Ø  भ्रूण वृद्धि के लिए pH 5.0 से 7.5 के मध्य रखी जाती है।

(The pH is kept between 5.0 and 7.5 for embryo growth.)

·   स्वपोषी अवस्था के भ्रूण के लिए सरल माध्यम की आवश्यकता होती है।

(Autotrophic stage embryos require simple medium.)

·   अंकुरण के लिए सुक्रोज युक्त सरल अकार्बनिक माध्यम की आवश्यकता होती है।

(Germination requires a simple inorganic medium containing sucrose.)

b. ताप प्रकाश (Temperature and Light):-

·   रबी फसलों के भ्रूण विकास के लिए कम तापमान की आवश्यकता होती है जबकि खरीफ फसलों के भ्रूण विकास के लिए उच्च तापमान की आवश्यकता होती है।

(Low temperature is required for embryonic development of rabi crops whereas high temperature is required for embryonic development of kharif crops.)

·   असामयिक अंकुरण को रोकने के लिए प्रारम्भिक संवर्धन अंधेरे में किया जाता है। अंधेरे में 1 – 2 सप्ताह रखने   के पश्चात पर्णहरित निर्माण के लिए बाद में इसे प्रकाश में स्थानांतरित कर दिया जाता है।

(Initial culture is done in the dark to prevent premature germination. After keeping 1 - 2 weeks in the dark, it is later transferred to the light for chlorophyll formation.)

4. भ्रूण बचाव की सामान्य विधियाँ (General Embryo Rescue Procedures):-

i. भ्रूण संवर्धन (Embryo Culture)

ii. बीजाण्ड संवर्धन (Ovule Culture)

iii. अंडाश्य संवर्धन (Ovary Culture)

i. भ्रूण संवर्धन (Embryo Culture):-

·  यह भ्रूण बचाव की बहुत अधिक सामान्य प्रक्रिया है जिसमें भ्रूणो को निकालकर सीधे संवर्धन माध्यम पर स्थापित किया जाता है।

(It is a very common process of embryo rescue in which embryos are extracted and placed directly on the culture medium.)

·   ऐसे नियंत्रित परागण वाले पौधों के फल जिनमें भ्रूण के नष्ट होने की संभावना रहती है उन्हें समय से पहले एकत्रित कर लिया जाता है।

(The fruits of such controlled pollinated plants, which are prone to embryo destruction, are collected before maturation.)

·   बीजों के अन्दर उपस्थित अपरिपक्व भ्रूण निर्जमित अवस्था में होते हैं इसलिए इनके निर्जमीकरण की आवश्यकता नहीं होती है। कुछ मामलों में सम्पूर्ण अंडाशय का सतही निर्जमीकरण किया जाता है।

(Immature embryos present in the seeds are in sterilized state, so they do not require sterilization. In some cases surface sterilization of the entire ovary is done.)

·   भ्रूण को बीज से निकालने के तुरन्त बाद सीधे माध्यम पर स्थापित कर दिया जाता है इसलिए यह सूखता नहीं है। हृदय नुमा तरुण भ्रूणो को इनके निलंबक सहित साबुत निकालना चाहिए।

(The embryo is placed directly on the medium immediately after it is extracted from the seed so it does not dry up. Heart shaped and young embryos should be removed intact with their suspensors.)

ii. बीजाण्ड संवर्धन (Ovule Culture):-

·   बहुत अधिक छोटे बीज वाली जतियों से बहुत अधिक तरुण भ्रूणो को निकालना कठिन होता है। भ्रूण को निकालते समय इनके क्षतिग्रस्त होने का खतरा रहता है। भ्रूण को क्षतिग्रस्त होने से बचाने के लिए   इसे बीजाण्ड के अन्दर रखकर ही संवर्धित किया जाता जाता है। इस तकनीक को बीजाण्ड संवर्धन कहते हैं।

(It is difficult to remove embryos from very small seeds and very young embryos. There is a risk of damage to the embryo while removing it. To protect the embryo from being damaged, it is cultured only by keeping it inside the ovule. This technique is called ovule culture.)

·  ऐसे नियंत्रित परागण वाले पौधों के पुष्प जिनमें भ्रूण के नष्ट होने की संभावना रहती है उन्हें निषेचन के तुरन्त बाद  एकत्रित कर लिया जाता है। अंडाशय का सतही निर्जमीकरण करके इसके अन्दर से बीजाण्डों को निकालकर   माध्यम पर स्थापित कर दिया जाता है।

(Flowers of plants with controlled pollination, that are likely to destroy the embryo, are collected immediately after fertilization. The ovary is surface sterilized and ovules are removed from it and placed on the medium.)

·   बड़े बीज वाली जातियाँ जिनमें केवल एक बीज होता है उनमें बीजाण्ड संवर्धन आसानी से कम समय में हो जाता है। जबकि छोटे बीज वाली जातियाँ जिनमें अनेक बीज होते हैं उनमें बीजाण्ड संवर्धन कठिन होता है अधिक   समय लेता है।

(In large seeded species that have only one seed, ovule culture is easily and in a short time. Whereas in small seeded species which contain many seeds, ovule culture is difficult and takes more time.)

iii. अंडाशय संवर्धन (Ovary Culture):-

·  ऐसे नियंत्रित परागण वाले पौधों के पुष्प जिनमें भ्रूण के नष्ट होने की संभावना रहती है उन्हें निषेचन के तुरन्त बाद  एकत्रित कर लिया जाता है। अंडाशय को छोड़कर पुष्प के शेष भागों को हटा दिया जाता है। अंडाशय का सतही   निर्जमीकरण करके इसे माध्यम पर स्थापित कर दिया जाता है।

(Flowers of plants with controlled pollination, that are likely to destroy the embryo, are collected immediately after fertilization. The remaining parts of the flower are removed except the ovary. The ovary is surface sterilized and placed on the medium.)

·   अंडाशय को माध्यम में इस प्रकार से स्थापित किया जाता है कि पुष्पवृंत माध्यम के अन्दर रहे।

(The ovary is placed on the medium in such a way that the pedicel remains inside the medium.)

·   प्रयोग के अन्त में अंडाशय पौधे में विकसित हो जाता है।

(At the end of the experiment the ovary develops into the plantlet.)

5. अनुप्रयोग (Applications):-

a. भ्रूण अपघटन को रोकना (Prevention of Embryo Abortion):- अंतरा-जातीय अंतरा-वंशीय संकरण   प्रोग्रामों में अनिषेच्यता बाधाओं के कारण भ्रूण का अपघटन हो जाता है। भ्रूण बचाव से इस समस्या का निवारण   हो जाता है। भ्रूण बचाव तकनीक के उपयोग से अनेक दूरस्थ संकर प्राप्त किए गए हैं जिनमें प्रतिरोधी लक्षण   विकसित करने के उद्देश्य से दूरस्थ संकरण कराया गया था। इनकी सूची नीचे दी गयी है

(Inter-specific and inter-generic hybridization programs embryo lead to degeneration due to incompatibility barriers. Embryo rescue solve this problem. A number of distant hybrids have been obtained using embryo rescue techniques in which wide hybridization was carried out with the aim of developing resistant traits. The list is given below.)

b. बीज प्रसुप्तावस्था से बचाव (Overcoming Seed Dormancy):-

·  बीज प्रसुप्तावस्था अनेक कारकों के द्वारा उत्पन्न की जाती है

(Seed dormancy is produced by several factors -)

Ø  अंतर्जात्त अवरोधक (Endogenous Inhibitors)

Ø  भ्रूण अपरिपक्वता (Embryo Immaturity)

Ø  विशिष्ट प्रकाश तापमान आवश्यकताएँ (Specific Light and Temperature Requirements)

Ø  शुष्क भंडारण आवश्यकताएँ (Dry Storage Requirements)

·   कुछ पौधों में बीज प्रसुप्तावस्था का प्राकृतिक काल अधिक लम्बा होता है।

(Some plants have a longer natural period of seed dormancy.)

·   भ्रूण संवर्धन द्वारा उपरोक्त समस्याओं का आसानी से निवारण किया जा सकता है।

(The above problems can be easily solved by embryo culture.)

c. जनन चक्र को छोटा करना (Shortening of Breeding Cycle):-

·   कुछ पौधों में प्राकृतिक रूप से जनन चक्र लम्बा समय लेता है। ऐसा अधिकतर बीज प्रसुप्तावस्था के कारण   होता है जिसके लिए बीज चोल भ्रूणपोष जिम्मेदार होते हैं।

(The reproduction cycle naturally takes a long time in some plants. This is mostly due to seed dormancy for which seed coat and endosperm are responsible.)

·   ऐसे बीजों से भ्रूणो को निकालकर कृत्रिम माध्यम पर संवर्धन करके बहुत कम समय में पौधे के रूप में विकसित किया जा सकता है।

(Embryos are removed from such seeds and can develop into plants by culturing on artificial medium in a very short time.)

·  उदाहरण के लिए Hollies (क्रिसमस सजावटी पौधा) बीज अंकुरण के द्वारा 3 वर्ष में अपना जनन चक्र पूर्ण करता है। जबकि भ्रूण संवर्धन के द्वारा 2 – 3 सप्ताहों में ही संतति पौधे उग जाते हैं।

[For example, Hollies (Christmas ornamental plant) completes its reproductive cycle in 3 years through seed germination. Whereas seedlings are developed in 2-3 weeks by embryo culture.]

d. बीज बंध्यता से बचाव (Overcoming Seed Sterility):-

·   कुछ पादप जातियाँ बंध्य बीज उत्पन्न करती हैं जो अंकुरित नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए Cherry, Apricot    Plum की शीघ्र पकने वाली किस्में।

(Some plant species produce sterile seeds that do not germinate. For example, early ripening varieties of Cherry, Apricot and Plum.)

·  बीज बंध्यता अधिकतर अपूर्ण भ्रूण विकास से संबन्धित होती है जिसके फलस्वरूप अंकुरित हो रहा भ्रूण नष्ट हो जाता है।

(Seed sterility is mostly related to incomplete embryonic development, resulting in the destruction of the germinating embryo.)

·  बंध्य बीजों से अपूर्ण विकसित भ्रूण को निकालकर कृत्रिम माध्यम पर संवर्धित करके संतति पौधे विकसित किए जा सकते हैं।

(Progeny plants can be developed by extracting incompletely developed embryos from sterile seeds and cultured on artificial medium.)

साइब्रिड्स (Cybrids):- जब कायिक संकरण के दौरान एक जाति से केन्द्रक कोशिकाद्रव्य तथा दूसरी जाति से केवल कोशिकाद्रव्य आते हैं तो इस प्रकार बने संकर को साइब्रिड कहते हैं।
(When nucleic and cytoplasm from one species and only cytoplasm from another species come during somatic hybrids, the hybrids thus formed are called cybrids.)
Applications of Cybrids (साइब्रिड्स के अनुप्रयोग):-
i. Cybrids are important for the transfer of Cytoplasmic male Sterility, antibiotic and herbicide resistance in agriculturally useful plants.
(साइब्रिड्स कृषि उपयोगी पौधों में कोशिकाद्रव्यी नर बाँझपन, एंटीबायोटिक और शाकनाशी प्रतिरोध के हस्तांतरण के लिए महत्वपूर्ण हैं।)
ii. Two different parental genome that can not reproduce sexually (a sexual or sterile) are recombined.
[दो अलग-अलग पैतृक जीनोम जो लैंगिक रूप से प्रजनन नहीं कर सकते (लैंगिक या बंध्य) पुनर्संयोजित होते हैं।]
iii. Overcomes sexual incompatibility barriers.
(लैंगिक असंगति की बाधाओं को दूर करता है।)
iv. Used in the study of cytoplasmic genes and their activities plant breeding experiments.
(कोशिकाद्रव्यी जीन और उनकी गतिविधियों के अध्ययन में पादप प्रजनन प्रयोगों में उपयोग किया जाता है।)
v. Used in mitochondrial research and have been used to provide suggestive evidence of mitochondrial involvement in Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease.
(माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान में उपयोग किया जाता है और अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग में माइटोकॉन्ड्रियल की भागीदारी के सुझावात्मक प्रमाण प्रदान करने के लिए उपयोग किया गया है।)
Auxotrophic mutants:- 
> These are bacteria, yeast, protoplast or mammalian host cell strains that can’t produce a nutrient vital for growth due to genetic mutations. As a result, these strains are unable to survive in media lacking that specific nutrient unless it is provided externally.
> The term auxotrophy refers to a nutritional dependency, where the mutant requires an auxiliary or supplemental source of the missing nutrient for its growth and survival. In contrast, the corresponding wild type strain can synthesize that specific nutrient and is not dependent on an exogeneous supply in the growth medium.
> Auxotrophic mutants are often used in genetic studies, selection experiments, and research involving metabolic pathways and nutrient utilization. They are also very useful in gene cloning procedures.
Sources of Genetic Variation:- Genetic variation refers to the differences in DNA sequences among individuals of the same species. It is the foundation of evolution, adaptation, and plant and animal breeding. Genetic variation provides the raw material for natural selection and helps populations survive changing environmental conditions. 
i. Mutation:- Mutation is the ultimate source of new genetic variation. It is a sudden, heritable change in the DNA sequence or chromosome structure. Mutations may occur naturally (spontaneous) or be induced by physical agents (X-rays, gamma rays) and chemical mutagens. They create new alleles that may be beneficial, harmful, or neutral.
ii. Recombination:- Genetic recombination occurs during meiosis through crossing over between homologous chromosomes and independent assortment of chromosomes. It produces new combinations of genes in offspring, increasing genetic diversity without changing the total number of genes.
iii. Gene Flow (Migration):- Gene flow is the transfer of genes from one population to another through migration of individuals or movement of pollen and seeds. It introduces new alleles into a population and reduces genetic differences between populations.
iv. Genetic Drift:- Genetic drift is the random change in allele frequencies, especially in small populations. It may lead to the loss or fixation of alleles, thereby altering genetic variation over generations.
v. Hybridization:- Crossing genetically different individuals, species, or varieties results in hybridization. It combines desirable traits from different parents and generates novel genetic combinations, widely used in crop improvement.
vi. Polyploidy:- Polyploidy is the multiplication of complete sets of chromosomes. It is common in plants and often results in increased variation, larger plant size, and improved adaptability.
vii. Artificial Selection and Biotechnology:- Modern breeding methods, genetic engineering, genome editing (CRISPR), and induced mutations create additional genetic variation for crop improvement.
Protoplast production (प्रोटोप्लास्ट उत्पादन):-
Protoplast Isolation (प्रोटोप्लास्ट पृथक्करण):- It has 2 main steps -
(इसके 2 मुख्य चरण हैं –)
a. Sterilization of Leaf (पर्ण का निर्जमीकरण)
b. Enzyme Treatment (एन्जाइम उपचार)
a. Sterilization of Leaf (पर्ण का निर्जमीकरण):- Soak the leaf in 70% ethanol for 1 minute. After this, keep this leaf in 2% NaOCl solution for 20 to 30 minutes. Now wash this leaf with distilled water for 3 minutes.
(पर्ण को 1 मिनट के लिए 70% एथेनॉल में डुबोकर रखते हैं। इसके पश्चात इस पर्ण को 20 से 30 मिनट के लिए 2% NaOCl विलयन में डुबोकर रखते हैं। अब इस पर्ण को 3 मिनट तक आसुत जल से धो लेते हैं।)
b. Enzyme Treatment (एन्जाइम उपचार):- Now this sterilized leaf is treated with 2 enzymes, pectinase and cellulase, respectively. The pectinase enzyme disintegrates the middle lamella. Cellulase enzymes decompose the cell wall. As a result protoplasts are obtained. To increase osmotic concentration, add 500 - 800 ml / L of sorbitol or mannitol.
(अब इस निर्जमित पर्ण को क्रमश: 2 एंजाइमों पेक्टीनेज व सेलुलेज से उपचारित कराया जाता है। पेक्टीनेज एन्जाइम मध्य पटलिका को विघटित कर देता है। सेलुलेज एन्जाइम कोशिका भित्ति को विघटित कर देता है। इसके फलस्वरूप प्रोटोप्लास्ट प्राप्त होते हैं। परासरणी सान्द्रता को बढ़ाने के लिए 500 – 800 ml/L सोर्बिटोल या मैनीटोल मिला देते हैं।)
Applications of protoplast production:- 
1. Study of Osmotic Behaviour:- 
Influence of different environmental factors on the osmotic behaviour can be studied using plant protoplasts.
2. Study of IAA Action:- 
> When growth promoters like IAA are ap­plied to plants, they act directly on plasma mem­brane of the cell and increase the permeability of the membrane to water resulting in cell elon­gation. This can be established by the use of protoplast in vitro.
> When IAA is applied to the plasmolyticum containing protoplasts they ex­pand rapidly and finally burst due to too much vacuolation. Further, it can be verified by using anti-auxins that sup­press this bursting, indicating that the site of action of IAA is the plasma-lemma of the plant cell.
3. Study of Plasma-lemma:-
When newly released protoplasts are placed in hypotonic solution or plain water, the proto­plasts burst within a second or if the protoplasts are dropped from a certain height on a glass slide, the same result will happen. So by this process, plasma-membrane can be isolated very easily from protoplast and a number of study on plasma-membrane can be investigated.
4. Study of Cell Wall Formation:-
The early deposition of cellulosic micro-fib­ril and their orientation at the protoplast surface can be followed using both light and electron mi­croscope and has also provided much basic infor­mation concerning cell wall biology.
5. Organelle Isolation:-
Protoplasts are very convenient material for the isolation of chloroplasts, mitochondria, nu­clei and even chromosomes. It has been demon­strated that chloroplasts particularly isolated from cereal protoplast have higher capacity for CO2 fixation than those obtained by mechanical grinding.
6. Study of Morphogenesis:-
> Isolated protoplast provides an ideal single cell system. Under suitable condition, protoplast regenerates its own wall and become the walled cells. Cell division followed by plant regeneration may occur from such unique single cell system either through organogenesis or embryogenesis.
> Plant regeneration is very important as well as significant for fusion experiment and for the experiment of genetic modification in proto­plasts.
7. Virus Uptake and Replication:-
> The plant virus interrelationships in the past were not clearly known due to lack of suit­able experimental systems that can easily infect the cells. But after the innovation of protoplast isolation and its culture, this problem is almost solved. 
> Protoplast can directly be inoculated with pathogenic virus in the medium. The pro­cess of uptake of virus particle, their replication inside the protoplasts and their mode of action at the molecular and cellular level are made pos­sible by the aid of protoplasts.
8. Study of Photosynthesis from Isolated Protoplast:- Elegant experiments to investigate various biophysical and biochemical aspects of photosynthesis in C3 and C4 plants have been carried out by a number of workers using protoplasts.
9. Isolation of Bacteriods from Root Nodule Protoplast:-
Viable bacteriods from root nodules of legu­mes has been isolated by first preparing nodule protoplast and then rupturing them either me­chanically or by lowering suddenly the concen­tration of the plasmolyticum in the surround­ing medium. This method ensures the freedom of the preparation of bacteria from the infection thread.
10. Induction of Mutation and Genetic Variability:-
> It has been repeatedly observed that plant cell in culture show a wide range of genetic diver­sity. This phenomena can be exploited by plant breeders and geneticists for inducing variability in protoplast culture. The recessive characters can be detected in the regenerated plants de­rived from haploid protoplasts. Therefore, hap­loid protoplast would make an ideal system for studying the effect of irradiation and for the in­duction of mutation by plating them in media supplemented with various chemical mutagens.
> From this method, mutant line can be se­lected.
11. Microorganism Transplantation:-
> Incorporation of microorganisms like bac­teria, blue-green algae, yeast etc. into proto­plasts has been attempted with the immediate objective of establishing endosymbiotic associa­tion with higher plant cells which may eventu­ally yield a plant having some beneficial activ­ity. Bacterial cell uptake by plant protoplasts has been investigated with species of Rhizobium and Spirillum.
> There are reports based on ultra- structural examinations that bacteria enter the cells by endocytosis and may become embedded in vesicles in the cytoplasm of protoplasts. Sim­ilar uptake studies were performed with yeast and blue green algae cells.
> Introduction of Anabaena variables and nitrogen fixing blue green al­gae Gleocapsa sp. into protoplasts has also been 15ported. However, nothing is known about the fate of the introduced microorganism, because there has been no reported evidence of survival or development of any organisms within the pro­toplasts.
12. Implantation of Chloroplast:-
> Plant protoplasts have ability to uptake the isolated chloroplasts by the process of endocy­tosis. Several reports have described uptake of chloroplasts. Chloroplasts isolated from Vaucheria dichotoma were implanted into carrot cell culture protoplasts. The chloroplasts may enter the cytoplasm enclosed in membrane-bound vesi­cles, although the enclosing membrane in some cases is absent.
> Biological evidence of chloroplast gene expression was presented but the ex­periments have not been confirmed. The inabil­ity and ability of chloroplasts to survive and mul­tiply in recipient protoplasts have not been un­equivocally demonstrated, although limited re­plication has been reported.
> Potentially the chloroplast uptake procedure offers an excellent approach to study chloroplast/ cytoplasm and nuclear interrelationships, genetics and physio­logical autonomy and specificity of functions of the organelles.
13. Transplantation of Nuclei:-
Isolated nuclei can be introduced into the protoplasts. Both intra and inter-specific nu­clear transplantation have been observed in Petu­nia hybrida, Nicotiana tabacum and Zea mays. Retention, normal function or degradation of the incorporated nuclei is not known. But it is really opening up new avenues for the study of nuclear- cytoplasmic interaction if fertile plants with for­eign nuclei could be regenerated from such pro­toplasts.
14. Transplantation of Chromosome:-
The uptake of isolated metaphase chromo­somes has proven successful in plant protoplast. This procedure provides a valuable method for genetic information transfer and gene analysis.
15. Somatic Hybridization:-
The main objective of protoplast culture lies in the possibilities of fusion of one protoplast with another. Normally isolated protoplasts do not fuse with each other, but in presence of fu­sion inducing agent like PEG, a protoplast of one species can be fused with one of a differ­ent species, thus a hybrid protoplast will be pro­duced.

महत्व (Importance):-

·    अपस्थानिक भ्रूणो का बड़े पैमाने पर उत्पादन किया जाता है।

(Adventitious embryos are produced on a large scale.)

·    अपस्थानिक भ्रूण द्विध्रुवीय होते हैं जो सीधे सम्पूर्ण पादपक का निर्माण करते हैं। अलग से मूल निर्माण   माध्यम की आवश्यकता नहीं होती है।

(The adventitious embryos are bipolar which directly develop into the entire plant. A separate root formation medium is not required.)

·    कायिक भ्रूणो में संग्रहित भोजन नहीं होता है। इनके कैप्सूलिकरण से कृत्रिम संश्लिष्ट बीजों का निर्माण किया   जाता है।

(Somatic embryos do not contain stored food. Artificial synthetic seeds are produced by their encapsulation.)

·   अंगजनन के विपरीत कायिक भ्रूण एकल कोशिकाओं से विकसित हो जाते हैं। इसलिए उतपरिवर्तन अध्ययन   में इनका अधिक महत्व है।

(In contrast to organogenesis, somatic embryos develop from single cells. Therefore, they are more important in the study of mutation.)

·    रोग मुक्त पौधे उत्पन्न किए जा सकते हैं।

(Disease-free plants can be produced.)

Male Sterility (नर बंध्यता):- जब किसी पौधे के परागकण निर्जीव व निष्क्रिय होते हैं तथा मादा युग्मक सजीव व सक्रिय होते हैं तो इसे नर बंध्यता कहते हैं। ऐसा बहुत कम होता है। उत्परिवर्तन के कारण ऐसा होता है। नर बंध्यता तीन प्रकार की होती है:-

(When the pollens of a plant are dead and inactive, while the female gametes are alive and active, it is called male sterility. This occurs very rarely. This occurs due to mutation. There are three types of male sterility: -)

1. आनुवांशिक नर बंध्यता (Genetic Male Sterility = GMS)

2. कोशिकाद्रव्यी नर बंध्यता (Cytoplasmic Male Sterility = CMS) 

3. कोशिकाद्रव्यी आनुवांशिक नर बंध्यता (Cytoplasmic Genetic Male Sterility = CGMS)

1. आनुवांशिक नर बंध्यता (Genetic Male Sterility = GMS):- जब केन्द्रक में उपस्थित एक अप्रभावी जीन के द्वारा नर बंध्यता का नियंत्रण होता है तो इसे आनुवांशिक नर बंध्यता (GMS) कहते हैं।

[When male sterility is controlled by a recessive gene present in the nucleus, it is called genetic male sterility (GMS).]

MS जीन = नर उर्वरता के लिए        

(MS gene = For male fertility)           

ms जीन = नर बंध्यता के लिए

(ms gene = For male sterility)


MS MS = नर उर्वर पौधा (Male fertile plant)

MS ms = नर उर्वर पौधा (Male fertile plant)

ms ms = नर बंध्य पौधा (Male sterile plant)

Maintenance (अनुरक्षण):- GMS के अनुरक्षण के लिए नर बंध्य पौधों का विषमयुग्मजी नर उर्वर पौधों से क्रॉस कराते हैं। इसके फलस्वरूप प्रत्येक पीढ़ी में 50 प्रतिशत नर बंध्य पौधे प्राप्त होते हैं।

(For maintaining GMS, male sterile plants are cross heterozygous male fertile plants. As a result, 50 percent male sterile plants are obtained in each generation.)

संकर बीज उत्पादन में उपयोग (Application in hybrid seed production):- संकर बीज उत्पादन के लिए नर बंध्य वंशक्रम को मादा जनक के रूप में उपयोग किया जाता है तथा उपयुक्त नर जनक वंशक्रम के साथ क्रॉस कराया जाता है। अरंडी व अरहर की फसल में GMS के उपयोग से संकर बीज का उत्पादन किया जाता है।

(For hybrid seed production, the male sterile line is used as the female parent and crosses with the appropriate male parent line. Hybrid seeds are produced using GMS in Castor and Pigeon pea crops.)

EGMS (Environment sensitive GMS):- आनुवांशिक नर बंध्यता पर वातावरण का बहुत अधिक प्रभाव पड़ता है। प्रकाशकाल व तापमान के द्वारा आनुवांशिक नर बंध्यता का निर्धारण किया जाता है। इस गुण का उपयोग धान की फसल में संकर बीज उत्पादन में किया जाता है। इस प्रकार EGMS दो प्रकार की होती है:

(The environment has a great impact on genetic male sterility. Genetic male sterility is determined by photo period and temperature. This property is used in hybrid seed production in paddy crop. Thus, there are two types of EGMS:)

i. TGMS (Temperature sensitive GMS)

ii. PGMS (Photoperiod sensitive GMS)

i. TGMS (Temperature sensitive GMS):- धान की फसल में आनुवांशिक नर बंध्यता पर तापमान का प्रभाव पड़ता है। 28°C से कम तापमान पर धान के पौधे पूर्णतया नर उर्वर होते हैं जबकि 30°C से अधिक तापमान पर धान के पौधे पूर्णतया नर बंध्य होते हैं। 

(Temperature has an effect on genetic male sterility in paddy crop. At temperatures below 28 ° C, paddy plants are completely male fertile while at temperatures above 30 °C, paddy plants are completely male sterile.)

TGMS line का अनुरक्षण (Maintenance of TGMS line):- इसके लिए धान के पौधों को ऐसे क्षेत्र में उगाया जाता है जहां का तापमान 28°C से कम रहता है। इस तापमान पर धान के पौधे पूर्ण नर उर्वर होते हैं। पौधों में स्वपरागण होने देते हैं, जिसके फलस्वरूप TGMS line के पौधे प्राप्त होते हैं जैसा कि नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

(For this, paddy plants are grown in an area where the day temperature remain below 28 ° C. At this temperature, paddy plants are fully male fertile. Now allow self-pollination in plants, resulting in the production of TGMS line seeds and then plants as shown in the diagram below.)

  

संकर बीज उत्पादन (Hybrid Seed Production):- इसके लिए धान के पौधों को ऐसे क्षेत्र में उगाया जाता है जहां का तापमान 30°C से अधिक रहता है। इस तापमान पर धान के पौधे पूर्ण नर बंध्य होते हैं जिन्हें मादा जनक के रूप में उपयोग किया जा सकता है। अब इन नर बंध्य मादा जनक पौधों का उपयुक्त नर जनक पौधे से क्रॉस कराया जाता है जिसके फलस्वरूप संकर बीज प्राप्त होते हैं जैसा कि नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

(For this, paddy plants are grown in an area where the temperature is above 30 ° C. At this temperature paddy plants are fully male sterile which can be used as female parent. Now these male sterile female parent plants are crossed with the appropriate male parent plant, resulting in the production of hybrid seeds as shown in the diagram below.)

  


ii. PGMS (Photoperiod sensitive GMS):- धान की फसल में आनुवांशिक नर बंध्यता पर प्रकाशकाल का भी प्रभाव पड़ता है। 10 घण्टे के प्रकाशकाल पर धान के पौधे पूर्णतया नर उर्वर होते हैं जबकि 14 घण्टे के प्रकाशकाल पर धान के पौधे पूर्णतया नर बंध्य होते हैं। 

(Photo period also has an effect on genetic male sterility in paddy crop. Paddy plants are fully male fertile at 10 hours of light period, while at 14 hours of light, paddy plants are completely male sterile.)

PGMS line का अनुरक्षण (Maintenance of PGMS line):- इसके लिए धान के पौधों को ऐसे क्षेत्र में उगाया जाता है जहां पर प्रकाशकाल 10 घण्टे के लिए उपलब्ध रहता है। इस प्रकाशकाल पर धान के पौधे पूर्ण नर उर्वर होते हैं। पौधों में स्वपरागण होने देते हैं, जिसके फलस्वरूप PGMS line के पौधे प्राप्त होते हैं जैसा कि नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

(For this, paddy plants are grown in an area where light period remain available for 10 hours. Paddy plants are fully male fertile in this condition. Now allow self-pollination in plants, resulting in the production of PGMS line seeds and then plants as shown in the diagram below.)

  

संकर बीज उत्पादन (Hybrid Seed Production):- इसके लिए धान के पौधों को ऐसे क्षेत्र में उगाया जाता है जहां पर प्रकाशकाल 14 घण्टे के लिए रहता है। इस प्रकाशकाल पर धान के पौधे पूर्ण नर बंध्य होते हैं जिन्हें मादा जनक के रूप में उपयोग किया जा सकता है। अब इन नर बंध्य मादा जनक पौधों का उपयुक्त नर जनक पौधे से क्रॉस कराया जाता है जिसके फलस्वरूप संकर बीज प्राप्त होते हैं जैसा कि नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

(For this, paddy plants are grown in an area where the light period lasts for 14 hours. Paddy plants are fully male sterile in this condition which can be used as female parent. Now these male sterile female parent plants are crossed with the appropriate male parent plant, resulting in the production of hybrid seeds as shown in the diagram below.)

2. कोशिकाद्रव्यी नर बंध्यता (Cytoplasmic Male Sterility = CMS):- जब कोशिकाद्रव्य के द्वारा नर बंध्यता का नियंत्रण होता है तो इसे कोशिकाद्रव्यी नर बंध्यता (CMS) कहते हैं। जब निषेचन होता है तो नर जनक से केवल केन्द्रक आता है और मादा जनक से केन्द्रक व कोशिकाद्रव्य दोनों आते हैं। इसलिए जब नर बंध्य मादा जनक का नर जनक से क्रॉस कराया जाता है तो प्राप्त होने वाले संकर बीजों से उत्पन्न होने वाले सभी पौधे नर बंध्य होते हैं जैसा की नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

[When male sterility is controlled by cytoplasm, it is called cytoplasmic male sterility (CMS). When fertilization occurs, only the nucleus comes from the male parent, while both the nucleus and cytoplasm come from the female parent. So when the male sterile female parent is crossed with the male parent, all the plants produced from the hybrid seeds are male sterile as shown in the diagram below.]

संकर बीज उत्पादन (Hybrid Seed Production):- ऐसी फसलें जिनमें बीज आर्थिक महत्व का होता है उनमें संकर बीज उत्पादन के लिए CMS का उपयोग नहीं किया जा सकता। परन्तु ऐसी फसलें जिनमें बीज की बजाय कोई कायिक भाग आर्थिक महत्व का होता है उनमें संकर बीज उत्पादन के लिए सीएमएस का उपयोग किया जाता है। जैसे - प्याज, लहसुन, गाजर, मूली आदि।

(CMS cannot be used for hybrid seed production in crops in which seed is of economic importance. But in crops where a somatic part is of economic importance rather than seed, CMS is used for hybrid seed production. Such as onion, garlic, carrot, radish etc.)

3. कोशिकाद्रव्यी आनुवांशिक नर बंध्यता (Cytoplasmic Genetic Male Sterility = CGMS):- जब केन्द्रक तथा कोशिकाद्रव्य दोनों के द्वारा नर बंध्यता का नियंत्रण होता है तो इसे कोशिकाद्रव्यी आनुवांशिक नर बंध्यता (CGMS) कहते हैं। कोशिकाद्रव्य मुख्य नियंत्रक होता है। केन्द्रक में उपस्थित प्रभावी जीन को पुन: स्थापक जीन कहते है जो कोशिकाद्रव्य के नर बंध्य प्रभाव को रोककर नर उर्वरता को पुन: स्थापित करने का कार्य करता है। इसे R से प्रदर्शित करते हैं। r निष्क्रिय जीन होता है।

[When male sterility is controlled by both nucleus and cytoplasm, it is called cytoplasmic genetic male sterility (CGMS). Cytoplasm is the main controller. The dominant gene present in the nucleus is called restorative gene, which acts to restore male fertility by preventing the male sterile effect of cytoplasm. We denote this as R letter. While r is the inactive gene.]

R जीन = नर उर्वरता के लिए  

(R gene = For male fertility)                                              

r जीन = निष्क्रिय होता है।

(r gene = For male sterility)


RR = नर उर्वर पौधा (Male fertile plant)

Rr = नर उर्वर पौधा (Male fertile plant)

rr = कोशिकाद्रव्य द्वारा निर्धारण होता है।

(Determined by cytoplasm.)


नीचे diagram में केन्द्रक व कोशिकाद्रव्य के विभिन्न संयोजन दिये गए है:-

(Different combinations of nucleus and cytoplasm are given in the following diagram: -)

संकर बीज उत्पादन (Hybrid Seed Production):- CGMS का संकर बीज उत्पादन में सर्वाधिक उपयोग किया जाता है। CGMS के उपयोग से संकर बीज उत्पादन के लिए Three line system विकसित किया गया है जिसमें निम्न तीन lines होती हैं:

(CGMS is most commonly used in hybrid seed production. A three line system has been developed for hybrid seed production using CGMS which consists of the following three lines:)

i. Aline:- यह नर बंध्य वंशक्रम है जिसे मादा जनक के रूप में उपयोग करते हैं।

(It is a male sterile line that is used as a female parent.)

ii. Bline:- यह नर उर्वर वंशक्रम है जिसे नर जनक के रूप में उपयोग किया जाता है। यह अनुरक्षक line है जो नर बंध्य Aline को अनुरक्षित करने का कार्य करती है।

(It is a male fertile line which is used as a male parent. It is the maintainer line that works to maintain the male sterile A - line.)

iii. Rline:- यह नर उर्वर वंशक्रम है जिसे नर जनक के रूप में उपयोग किया जाता है। यह पुन:स्थापक line है जो नर उर्वरता को पुन: स्थापित करने का कार्य करती है।

(It is a male fertile line which is used as a male parent. It is a restore line that works to restore the male fertility in hybrid plants.)

Aline के अनुरक्षण के लिए इसका क्रॉस Bline के साथ कराया जाता है। संकर बीज उत्पादन के लिए Aline का क्रॉस Rline के साथ कराया जाता है जैसा कि नीचे diagram में प्रदर्शित किया गया है।

(To maintain the A-line, its cross is made with the B-line. For hybrid seed production, the A-line crosses with the R-line as shown in the diagram below.)